经过单细胞转录组测序技能得到海量细胞的表达矩阵，能够对细胞亚群做聚类、注释，判定亚群marker genes，寻觅组间差异调控网络，制作安排特异性图谱.....除了这些根本剖析思路外，还有没有其他办法能够发掘出隐藏在丰厚数据里的瑰宝呢？今日细胞轨道剖析告知你~

　　一个安排样本中一起含有处于不同分解阶段的细胞，单细胞转录组测序技能一个样本可检测上千乃至上万个细胞，记录下样本中不计其数个细胞的瞬时信息，在没有多时刻点样本的状况下，运用单细胞数据进行细胞轨道剖析，也能协助构建细胞分解进程的图谱。相较传统的细胞谱系追寻办法，细胞轨道剖析能够在单细胞分辨率验证已知的细胞分解联络，简略又高效，还能揣度不知道的细胞分解途径，发掘一些稀疏的中间状况细胞，解析细胞分解进程中的起调控效果的要害基因，在发育生物学中细胞分解、谱系发育研讨方向、肿瘤/疾病微环境中免疫细胞的动态改变研讨中均有广泛运用。

　　现在进行细胞轨道剖析的办法和软件非常之多，大致能够归纳为两种办法，一种是以monocle软件为代表的拟时序剖析（pseudotime analysis），另一种则是以velocyto /scVelo为主的RNA速度剖析（RNA velocity）。

　　Monocle2[2]是现在引用率比较高的一款软件，依据基因表达量的动态改变来构建细胞轨道，软件简略易操作，且功用较全面，能满意根本剖析所需的细胞分解轨道类型；软件更新速度也比较快，假如细胞通量较高会严重影响Monocle2的运转速度，进行大数据集剖析时需求选择特定细胞类型来削减核算量，这个问题在Monocle3中得到了处理。Monocle2会默许分解轨道的起点，但这个起点不一定契合生物学含义，所以需求依据样本本身的生物学布景，选择已知或潜在存在分解联络的细胞类型显得尤为重要，来清晰正确的细胞分解起点和结尾。

　　a.转录动力学建模捕捉未剪接前 mRNA 的转录激活和按捺（“开”和“关”阶段）这些转录本转化为老练的mRNA并终究降解；b.当转录激活和按捺的转录阶段别离继续满足长的时刻时，别离到达活泼转录和非活泼稳态。但是，特别是在瞬态细胞群中，一般不会到达安稳状况，例如，转录激活或许在 mRNA 水平饱满之前停止，表现出提前转化”行为；c. 依据似然的模型，处理剪接动力学的完好基因转录动力学，它由两组参数操控：（1）转录、剪接和降解的反响速率（2）细胞-转录状况和时刻的特定潜在变量。经过 EM 迭代地揣度参数。关于给定的反响速率参数估计，经过最小化每个单元与当时相轨道的间隔来将时刻点分配给每个单元。转录状况是经过将或许性与轨道上的各个片段相关联来分配的——即激活、按捺以及活泼和不活泼的稳态。d.然后经过更新反响速率的模型参数来优化全体或许性。紫色虚线将揣度的（未观察到的）非活动状况与活动安稳状况联络起来。

　　相较于拟时序剖析来说，RNA velocity剖析的是细胞在某一时刻的潜在分解方向，能够直接从具有时刻向量的效果读取到分解方向，无需依据生物学布景指定分解起点和结尾；一起RNA velocity的数据能够与Seurat降维数据兼容，也能够嵌入monocle构建细胞轨道，这关于联合两种剖析战略非常便当，运用RNA velocity剖析提醒一切不知道的细胞分解联络，然后挑选重视的细胞分解进程进行拟时序剖析，发掘分解进程中的调控机制。

　　百迈客可供给以上两种细胞轨道剖析，有需求的教师可联络百迈客当地出售，或在谈论区留言，欢迎各位教师前来咨询。

　　上文有提过，细胞轨道剖析现在在细胞分解、谱系发育、肿瘤/疾病微环境中免疫细胞的动态改变研讨中均有广泛运用，大致能够归纳为以下三种运用场景：

　　2020年Cell stem cell宣布的The Dynamic Tranional Cell Atlas of Testis Development during Human Puberty[6]，研讨依据前期研讨根底将人睾丸生殖细胞分为对应4个发育阶段的细胞亚型：未分解的精原细胞、分解的精原细胞、精母细胞、精子细胞；一起运用拟时序剖析，证明了生殖细胞由未分解的精原细胞向精子细胞分解的发育轨道（图4）。

　　除了判定已知的细胞分解进程，经过细胞轨道剖析也能揣度未被报导的、或许的不知道细胞分解途径，如神经干细胞发育、肿瘤/疾病微环境中免疫细胞分解进程，乃至发掘到一些稀疏的、惯例技能手段很难取得的中间状况细胞。

　　经过细胞轨道剖析，剖析处于重要分解节点的要害细胞亚群，寻觅跟着分解时刻出现特定表达形式的要害基因，解析驱动细胞亚群分解的调控机制。

　　## 输出效果，在cellranger的效果中会创立单个样本的velocyto文件夹，其间的loom文件即为终究效果

　　运用scVelo进行剖析时需求对数据进行降维聚类，若上游剖析的降维聚类注释效果依据Seurat，能够直接将Seurat的降维聚类效果添加到adata目标中，下面办法仅供参考。此外，假如上游剖析依据scanpy，则能够直接调用scanpy的降维聚类相关的办法。注：此处并没有进行注释，在实际操作中将 seurat_cluster替换为注释后的信息即可，导入seurat之后的一切调用的办法中的groupby参数设置为 seurat_cluster。

　　RNA-速度：速度是基因表达空间中的向量，代表单个细胞运动的方向和速度。速度是经过模仿剪接动力学的转录动力学取得的，关于每个基因，拟合了老练（未剪接）和老练（剪接）mRNA计数的稳态比率，这构成了安稳的转录状况。正速度表明基因被上调，这种状况发生在该基因未剪接mRNA丰度高于预期的安稳状况的细胞中。相反，负速度表明基因被下调。

　　埋伏时刻：动力学模型描绘了细胞进程的埋伏时刻（这个埋伏时刻代表细胞的内部时钟，并近似于细胞在分解时阅历的实在时刻，仅依据其转录动力学。）

　　依据RNA-速度的PAGA剖析：PAGA供给了轨道揣度构图的办法，其间加权边对应于两个集群之间的衔接。在这里，PAGA经过速度揣度的方向性进行了扩展。

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